細(xì)菌原位雜交介紹之三-----不同標(biāo)本類型的檢測(cè)
1.培養(yǎng)后的細(xì)菌原位雜交：
（1） 細(xì)菌FISH探針的濃度為25-60μg/ml，即大約5-25μM濃度，雜交液稀釋20-50倍。
（2） 將菌株震蕩混合10秒，用鉆石筆在玻璃上畫圈，利用移液槍滴加50μL的細(xì)菌，并將載玻片置于37℃或室溫干燥后1-24小時(shí)。
（3） 利用梯度乙醇濃度(50%，85%和95%)脫水，每次3分鐘。在100%乙醇中脫水后，將載玻片風(fēng)干，約1-60分鐘。
（4） 雜交液稀釋細(xì)菌探針（1:50）。取50μL探針溶液加在玻片上，加玻片，多出溶液用紙巾擦拭。放入孵育盒，然后蓋好密封蓋，避光48°C中雜交5小時(shí)或37℃過夜。
（5） 配置洗滌緩沖液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡30分鐘。
（6） 再利用純水浸泡10分鐘，去除多余的鹽分。每片加50μL 抗熒光淬滅劑DAPI，室溫避光靜置20分鐘。熒光顯微鏡下，觀察結(jié)果，拍照。
2.新鮮組織的細(xì)菌原位雜交：
（1） 取材新鮮活體組織，使用卡氏固定液，固定3-12小時(shí)。石蠟包埋，切片5-8μM。
（2） 二甲苯中浸泡2次，10分鐘每次，在梯度乙醇50%，80%和95%中，按順序脫水，每次3分鐘，晾干標(biāo)本，約1-2小時(shí)。
（3） 將雜交液與探針按照25:1稀釋細(xì)菌探針。取50μL探針溶液加在玻片上，加玻片，紙巾擦拭干凈。放入保濕孵育盒，封蓋，避光48°C中雜交5小時(shí)，或37℃過夜。
備注：如果是陳舊標(biāo)本需要使用細(xì)菌原位雜交試劑進(jìn)行處理，如需要，請(qǐng)聯(lián)系我們。
（4） 洗滌緩沖液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡30分鐘。
（5） 再利用純水浸泡10分鐘，去除多余的鹽分。每片加50μL 抗熒光淬滅劑DAPI，室溫避光靜置20分鐘。觀察結(jié)果。
（6） 在40倍或60倍或100倍熒光顯微鏡下觀察，拍照。
3.血清和嘔吐物的細(xì)菌原位雜交：
（7） 細(xì)菌FISH探針的濃度為25-60μg/ml，即大約5-25μM濃度，雜交液稀釋20-50倍。
（8） 將血清或嘔吐物，混合10秒，12000rpm，離心1分鐘，用鉆石筆在玻璃上畫圈，利用移液槍滴加20-50μL的細(xì)菌，將載玻片置于56℃30min，或室溫干燥1-24小時(shí)。
（9） 滴加梯度乙醇濃度(50%，85%和95%)脫水，每次1分鐘。將載玻片風(fēng)干，約20分鐘。
（10） 雜交液稀釋細(xì)菌探針（1:50）。取50μL探針滴液加到玻片，蓋玻片覆蓋，多出溶液用紙巾擦拭。放入孵育盒，然后蓋好密封蓋，避光56°C中雜交2小時(shí)或37℃過夜。
（11） 配置洗滌緩沖液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡10-30分鐘。
（12） 再利用純水浸泡10分鐘，用手甩干。每片加50μL 抗熒光淬滅劑DAPI，室溫避光靜置20分鐘。熒光顯微鏡下，觀察結(jié)果，拍照。
4.流式細(xì)胞與核酸雜交技術(shù)結(jié)合----細(xì)菌檢測(cè)
外顯子生物專業(yè)提供熒光原位雜交探針多年，探針涵蓋DNA、mRNA、miRNA、cicrRNA、LncRNA、nascent RNA、piRNA、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等原位雜交探針以及配套試劑盒和配套原位雜交檢測(cè)設(shè)備。熟練應(yīng)用各種核酸探針標(biāo)記方法。
流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用廣泛，我們利用流式細(xì)胞術(shù)與FISH技術(shù)結(jié)合，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)菌、血液微生物，血液培養(yǎng)、痰液、肺泡灌洗液、污染的食品痰進(jìn)行探針雜交，然后進(jìn)行流式分析，發(fā)現(xiàn)探針雜交后細(xì)菌能很好地應(yīng)用于流式分析和分選出目的細(xì)菌，可以在感染血液、痰液等樣品中快速檢測(cè)和識(shí)別感染的種水平的微生物。與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法PCR、測(cè)序、培養(yǎng)等技術(shù)。流式-FISH結(jié)合的方法，快速檢測(cè)特定的細(xì)菌，初步試驗(yàn)還表明可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分選，檢測(cè)常見感染10多種微生物，如肺炎克雷伯氏菌屬肺炎克雷伯菌，鏈球菌、金黃色葡萄球菌，致病大腸桿菌等等，甚至還有一些真菌和部分寄生蟲。
流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于原位雜交，對(duì)標(biāo)本處理要求不同，不需要用福爾馬林固定，對(duì)標(biāo)本是當(dāng)處理，適合用于快速鑒別在各種肺部感染、敗血癥患者、腸道感染微生物檢測(cè)，能達(dá)到屬或種的水平檢測(cè)。
流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)步驟
（1） 血清、污水、嘔吐物、牛奶等液體，適當(dāng)?shù)娜芤禾幚恚?/span>8000rpm，離心1分鐘；
（2） 吸取上清20μL，加入配置好的核酸探針，85℃加熱樣品5分鐘，60℃孵育30分鐘；
（3） 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，流式務(wù)必做好對(duì)照。包括只含空白探針對(duì)照、單純待檢測(cè)樣品對(duì)照、待檢測(cè)樣品對(duì)照。
（4） 結(jié)果分析，設(shè)門的時(shí)候需要，顆粒大小參考對(duì)照，熒光變化參考對(duì)照。
如果遇到更多問題，請(qǐng)聯(lián)系我們。我們提供探針、試劑盒、耗材、設(shè)備等等。
聯(lián)系電話：020-89895006 180 1199 7127 (24小時(shí)) E mail：focobio@126.com
